OMICS ТЕХНОЛОГИИ Иммунофенотипирование: Проточная цитофлюорометрия (продолжение) Эта технология (the flow cytofluorometry) широко используется, главным образом, для быстрого определения субпопуляций клеток в периферической крови, образцах ткани и клеточных суспензиях, и связывания гормонов и вирусов к рецепторам на поверхности клеток, измерения внутриклеточных компонентов (общей ДНК, новосинтезированной ДНК и т.д.) и процессов (апоптоз, мобилизация внутриклеточного кальция и др.). Метод основан на связывании меченных флюорохромами моноклональных антител к поверхностным маркёрам клеток и учёте некоторых физических свойств этих клеток (диаметр ядра и соответственно размер клетки, а также гранулярность) при пропускании через них лазерного излучения. Лучи лазера трёх типов (двух рассеянных и одного флюоресцирующего) последовательно пропускаются через каждую клетку. Фотодетекторы преобразуют фотоны света в электронные сигналы, которые анализируются компьютером. Клетки отображаются на плотах - диаграммах, отображающих клеточные скопления с одинаковыми параметрами рассеивания света и спектра флюоресценции. Сначала предварительно меченные моноклональными антителами с флюорохромами клетки пропускаются через рассеянный свет, направленный прямо, и рассеянный свет под углом 90°. Световые сигналы фокусируются с помощью линз в фотодиодной трубке на фотодетекторы, усиливаются и измеряются. Первый параметр, Forward Scatter Count (FSC), позволяет идентифицировать размер клетки (большой или маленький), а второй, Side Scatter Count (SSC), - даёт возможность определить наличие или отсутствие гранул в цитоплазме данной клетки. Этих двух параметров бывает достаточно, чтобы отличить лимфоциты от моноцитов и полиморфно-ядерных лейкоцитов. Затем с помощью иммунофлюоресценции устанавливается наличие или отсутствие антигенных маркёров на поверхности клетки, что позволяет отнести её к соответствующей субпопуляции. Для этих целей клетки, как указывалось выше, были предварительно мечены моноклональными антителами, конъюгированными с различными флюорохромами, которые имеют разный спектр флюоресценции. Например, fluorescein isothiocyanate (FITC) показывает зелёное свечение, а R-phycoerythrin (PE) - жёлто-оранжевое. Каждая клетка может быть помечена одновременно, по крайней мере, четырьмя маркерами. Световые сигналы в многоскладчатых фототрубках (Photo Multiplier Tubes - PMT) фокусируются на фотодетекторы, усиливаются и регистрируются по отдельности как параметры Fluorescence Light (FL). Каждый параметр FL позволяет оценить содержание клеток, имеющих соответствующую метку и относящихся к соответствующей субпопуляции. Компьютер записывает информацию о тысячах клеток в одном образце, представляет её графически в виде плотов и распечатывает. Более того, данная технология даёт возможность также на основе отличающихся физико-химических свойств сортировать и собирать различные клетки в отдельные пробирки. Посмотрите, как выполняется процедура измерения субпопуляций лимфоцитов, меченных антителами против CD3 (FITC), CD4 (PE) и CD8 (PE). ©В.В.Климов 2000-2015