OMICS ТЕХНОЛОГИИ
Иммунофенотипирование: Проточная цитофлюорометрия (окончание)
Правильное окрашивание клеток Клетки ресуспензируются в концентрации 5 x 106
кл./мл в изотоническом растворе (например, PBS), инкубируются с антителами, меченными
флюорохромом и отмываются в соответствии с инструкцией производителя. Среда для цитометра
(sheath fluid) фильтруется для удаления возможных частиц.
Выбор правильного вольтажа для детекторов FSC и SSC Используя соответствующие количества клеток для детекторов FSC и SSC,
необходимо выбрать правильные значения вольтажа так, чтобы клеточные популяции чётко
различались на плоте (L - лимфоциты, M - моноциты,
PMN -полиморфно-ядерные лейкоциты).
Используя соответствующие количества клеток для детекторов FL, необходимо
выбрать правильный вольтаж таким образом, чтобы получить наилучшую позицию на плоте для
субпопуляции, меченной каждым флюорохромом. Однако, выбор вольтажа должен сопровождаться
отрицательным контролем на основе изотипа антител (см. ниже). После этого проверяется
разграничение кластеров клеток, меченных одним из флюорохромов (например, anti-CD3 FITC
и anti-CD8 PE), от неокрашенных клеток, которые не связывают антитела.
Контроль изотипа антител (isotype antibody control) Чтобы отличить специфический сигнал фоюресценции от неспецифических
сигналов рассеянного света (фон), может применяться контроль изотипа антител (например,
IgG2a FITC и IgG2b PE). Антитела, применяемые для этого, должны быть идентичны по изотипу
и флюорохрому тестируемым антителам.
Распределение компенсации Если клетки мечены более, чем одним флюорохромом, используется компенсация.
Компенсация (сompensation) - это перенесение (вычитание) перекрывающих световых сигналов из
показаний одного детектора FL на другой (FL1- %FL2 и наоборот). Например, компенсация позволяет
удалить перекрывающие сигналы в оранжево-зелёном спектре таким образом, чтобы зелёная
флюоресценция регистрировалась только на детекторе FL1, а оранжевая - только на FL2.
С этой целью для клеток, меченных только anti-CD3 FITC, первоначально, в условиях ранее
выбранного оптимального вольтажа для FL1, находится такая компенсация, чтобы на детекторе
FL2 регистрировалась отрицательная FITC-флюоресценция. Если компенсация оптимальна, то
медианы, проведённые через кластеры клеток, совпадают. По аналогии с описанным выше,
выбирается компенсация для клеток, меченных только anti-CD8 PE, так, чтобы отрицательная
PE-флюоресценция наблюдалась на детекторе FL1.
Расчёт содержания клеток Первоначально для каждой пары исследуемых антител (anti-CD3 FITC/anti-CD8 PE
и anti-CD3 FITC/anti-CD4 PE) проводится контроль изотипа антител (IgG2a FITC и IgG2b PE).
Если контроль отрицателен, можно определять квадранты на плоте для статистического анализа
субпопуляций. Исследуемая субпопуляция может быть выделена двумя перпендикулярными линиями
для любого желаемого статистического параметра. ©В.В.Климов 2000-2015
Выбор правильного вольтажа для детекторов FL
